Condicionamiento de la receptividad endometrial en pacientes con fallas recurrentes de implantación en fertilización in vitro

Conditioning of endometrial receptivity in patients with recurrent in vitro fertilization failure

Resumen

Pregunta de estudio: ¿La receptividad endometrial en pacientes con fallas recurrentes de implantación en tratamientos de fertilización in vitro (RIF) está condicionada por alteraciones en el programa de decidualización?

Lo que se sabe: La decidualización de las células estromales endometriales involucra un espectro de cambios de los cuales dependerá la receptividad endometrial.

Respuesta resumida: Las pacientes con RIF presentan alteraciones en el programa de decidualización, en la respuesta inflamatoria asociada y en la adhesión del blastocisto.

Diseño del estudio: cuasi experimental controlado.

Materiales y Métodos: El análisis bioinformático integrado incluyó información de bases de datos públicas (Reactome, Gene Ontology, WikiPathways, KEGG, GEO) y el Software Gephi para el armado de las redes de genes asociados al proceso de decidualización. Como modelo in vitro de decidualización se usó la línea celular HESC (Human Endometrial Stromal Cells) y ex vivo, biopsias de endometrio de mujeres con RIF y fértiles. Los genes IFGBP1, Prolactina, NLPRP3 e ITGA8 fueron cuantificados por RT-qPCR; IL-1β por marcación intracitoplasmática y citometría de flujo.

Resultados: El análisis in síllico de los procesos de decidualización, inflamación y regulación genética permitió identificar una red de genes que los conectan. En las células HESC decidualizadas se confirmó el aumento de la respuesta inflamatoria (activación del inflamasoma NLRP3 y de la producción de IL-1β activa). En otro análisis bioinformático se encontró la expresión diferencial de genes a partir de arrays de pacientes con RIF y de pacientes fértiles. La validación en biopsias de endometrio de pacientes con RIF, mostró una expresión disminuida significativamente de IFGBP1 y prolactina, NLRP3 e ITGA8 (integrina involucrada en la adhesión del blastocisto) comparado con la expresión de estos genes de pacientes fértiles.

Limitaciones del estudio: Si bien los resultados fueron validados en muestras de endometrio se necesitan más estudios para dilucidar si estos mecanismos operan de manera similar in vivo.

Implicancias de los hallazgos: El entendimiento de alteraciones en el programa de decidualización aportaría a esclarecer la “memoria del endometrio”, un campo muy poco explorado aún.

Palabras clave: decidualización, inflamación, fallas recurrentes en las fertilizaciones in vitro.

Summary

Study question: Is the endometrial receptivity in patients with recurrent implantation failures (RIF) conditioned by an alteration in the decidual program?

What is known: Decidualization of endometrial stromal cells involves a spectrum of changes from which endometrial receptivity arose.

Summary answer: Patients with RIF present alterations: in the decidualization program, in the associated inflammatory response and in the adhesion of the blastocyst.

Study design: exploratory, prospective case-control type.

Materials and Methods: The integrated bioinformatic analysis included information from public databases (Reactome, Gene Ontology, WikiPathways, KEGG, GEO) and used Gephi Software for the assembly of the networks. The HESC (Human endometrial stromal cells) cell line was used as an in vitro model of decidualization, and ex vivo, endometrial biopsies from women with RIF and fertile. The IFGBP1, Prolactin, NLPRP3 and ITGA8 genes were quantified by RT-qPCR; IL-1β by intracytoplasmic labeling and flow cytometry.

Results: The in-silico analysis of the processes of decidualization, inflammation and genetic regulation allowed us to identify a network of genes that connect them. In decidualized HESC cells, we confirmed the increase in the inflammatory response (activation of the NLRP3 inflammasome and the production of active IL-1β). In another bioinformatic analysis we studied the differential expression of genes from arrays of patients with RIF. Validation in endometrial biopsies from patients with RIF showed significantly decreased expression of IFGBP1 and prolactin, NLRP3 and ITGA8 (integrin involved in blastocyst adhesion).

Study limitations: Although the results were validated in endometrial samples, further studies are needed to elucidate whether these mechanisms operate similarly in vivo.

Implications of the findings: The understanding of alterations in the decidualization program would contribute to clarify the "memory of the endometrium", a field that has not yet been explored.

Keywords: decidualization, inflammation, recurrent implantation failures.

Introducción

La decidualización es un proceso celular esencial para la implantación del embrión y posterior establecimiento del embarazo (1). Este proceso involucra un espectro de cambios biomecánicos y transiciones bioquímicas de las células estromales que dependerán del contexto de señalización, dado tanto por las hormonas como por mediadores locales, para establecer un ambiente uterino receptivo (2). La decidualización también se caracteriza por el crecimiento de las arterias espiraladas uterinas y la infiltración del estroma por leucocitos maternos que junto con la producción de inmunomoduladores, regularán la invasión del trofoblasto y la formación de una interfase materno-fetal (3).

De lo expuesto se desprende que un inadecuado fenotipo decidual, inevitablemente generará complicaciones en la gestación, que dependiendo del grado de severidad, puede reflejarse en fallas reiteradas de implantación en las fertilizaciones in vitro (RIF del inglés: recurrent imlantation failures), pérdidas recurrentes del embarazo o complicaciones asociadas con una placentación inadecuada como la preeclampsia (4,5). Sin embargo, los mecanismos que llevan a las alteraciones de este proceso aún se desconocen.

Cuando el blastocisto entra en contacto con el epitelio uterino comienza un diálogo embrio-endometrial que mediará la implantación embrionaria (6).  Particularmente, la adhesión estable es el resultado de los cambios moleculares tanto en la superficie del trofoblasto como en la del endometrio. Esta adhesión entre células de orígenes distintos está mediada por la inducción de moléculas de adhesión en la superficie celular uterina durante la ventana de implantación, especialmente por las integrinas, responsables de mediar uniones estables. Seguidamente, la capa más externa, el trofoblasto, comenzará un camino invasivo en la decidua permitiendo su inclusión en el endometrio (6).

La generación de un microambiente inflamatorio durante la implantación embrionaria es crucial y por ello fisiológicamente se incrementan la expresión de la mayoría de las citoquinas inflamatorias (7). Entre ellos, la familia de IL-1 y particularmente sus miembros IL-1α e IL-1β que se expresan tanto en el endometrio como en el blastocisto (8). En cuanto a la relevancia de la IL-1β, la expresión de esta citoquina está altamente preservada en primates y ha sido propuesta como uno de los mediadores en la viviparidad placentaria que aumenta la receptividad del endometrio (9,10). Actualmente, la evidencia señala que la IL-1β contribuye a la decidualización por varios mecanismos tales como: la inducción de integrinas; la producción del factor inhibidor de leucemia (LIF) y de leptina (4) y la disociación de  actina filamentosa en células estromales humanas (11).

En el presente trabajo nos propusimos realizar un análisis bioinformático integrado exploratorio utilizando bases de datos públicas para estudiar aquellos genes que interconectan el proceso de decidualización, con la respuesta inflamatoria estéril, implantación y placentación. A través de la validación de los resultados en un modelo in vitro de decidualización y ex vivo, utilizando biopsias de endometrio de pacientes con RIF y de mujeres fértiles. De este modo, se pretende aportar al conocimiento de los mecanismos involucrados en el condicionamiento de la receptividad endometrial así como sus alteraciones en pacientes con RIF.

2- Materiales y Métodos

Diseño del estudio: experimental controlado in vitro

2.1 Análisis bioinformático integrado

Se realizó una búsqueda en de las posibles vías de señalización o pathways involucrados en los procesos de decidualización, placentación, angiogénesis, inflamación y regulación inmune en bases de datos públicas (Reactome, Gene Ontology, Wikipathways y KEGG). De esta búsqueda se obtuvieron 32 pathways, los cuales fueron asociados a cada uno de los procesos anteriormente indicados. Posteriormente, se extrajeron los genes que forman parte de los pathways, manteniendo su asociación con cada proceso y eliminando duplicados. A partir de estos datos, se generaron las tablas de nodos (996 genes + 5 procesos) y aristas (1154) y se construyó la red usando Gephi. La forma de la red se obtuvo por el algoritmo ForcedAtlas2 a partir de una distribución aleatoria hasta autoestabilizarse. El tamaño de los nodos es proporcional al número de aristas recibidas.

En una segunda etapa, se buscaron arrays públicos en la base de datos GEO del NCBI. Se seleccionaron arrays de células endometriales con estímulos inflamatorios o de mujeres con RIF (GSE58144, GSE92324, GSE103465, GSE111974, GSE174689). Se extrajeron los genes que se modulaban significativamente (p<0.05; FDR<0.25) utilizando la plataforma genepattern, y se aplicó este resultado sobre los genes de la red indicando con color su modulación.

2.2 – Cultivo celular

Las células HESC, línea celular de estroma endometrial humano, fueron cultivadas a 37°C y 5% CO2 en 3ml de medio DMEM F12 high glucose (Invitrogen) suplementado con 10% Suero Fetal Bovino (SFB, Natocord), antibióticos (PenStrepto, Invitrogen) y glutamina (Invitrogen) 20mM (medio completo). Las células crecieron en monocapa en botellas de 25 cm² (Botellas T25) y se reemplazó el medio cada 48 h en cabina de seguridad biológica de clase II hasta alcanzar un 80% de confluencia, momento en el cual se expandieron. Para ello, las células fueron tratadas con TrypLE® (GIBCO) por 2 a 5 minutos a 37ºC para lograr
despegarlas de la placa. A continuación, se suspendieron en medio completo y se
sembró el 20% de las células en una placa nueva.

2.3 - Protocolo de decidualización de células HESC

Las células HESC, cultivadas como se indicó previamente, fueron sembradas en
placa de 24 pocillos (20.000 células/pocillo) y se estimularon con 2,5mM de dibutirilAMPc (dbAMPc, SIGMA) y 0,1uM de medroxiprogesterona (MPA, SIGMA). El
tratamiento se realizó por 8 días renovando el 50% del medio y los estímulos cada
48 h. Pasados los 8 días de diferenciación las células fueron lavadas con medio
completo y utilizadas para los diferentes ensayos. Las células no diferenciadas (control
negativo) se mantuvieron con medio completo durante la misma cantidad de días.

2.4 – Reclutamiento de pacientes y obtención de Biopsias de endometrio

Pacientes con fallas reiteradas en las fertilizaciones in vitro. Las pacientes fueron invitadas a participar en el presente protocolo de investigación y seleccionadas según los siguientes criterios de inclusión:

- Mujeres entre 25 y 42 años

-Firma del consentimiento informado

- Dos o más FIV previas fallidas con al menos 1 embrión en estadio de blastocisto de buena calidad transferidos en cada intento (Consenso Estambul), de tratamientos con óvulos propios o donados

-Cavidad uterina normal, evaluada por histerosalpingografía, histeroscopía y/ o ecografía transvaginal.

-FSH de fase folicular menor a 10UI y/o HAM > a 1 ng/ ml

-Conteo folículos antrales basal ≥  10 (en uno o en los dos ovarios)

-TSH menor a 2,5 UI.

-Medicación concomitante permitida: metformina, ácido fólico, levotiroxina, sulfato ferroso, antioxidantes, vitamina E.  

Criterios de exclusión:

-Pacientes con hidrosalpinx uni o bilateral

-Útero con adenomiosis

Mujeres Fértiles (Grupo control)

Criterios de inclusión:

- Mujeres entre 25 y 42 años

-Firma del consentimiento informado

- Cavidad uterina normal, evaluada por ecografía transvaginal.

-TSH menor a 2,5 UI.

-Medicación concomitante permitida: metformina, ácido fólico, levotiroxina, sulfato ferroso, antioxidantes, vitamina E.  

Criterios de exclusión:

-Que hayan tenido alguna pérdida de embarazo

-Pacientes con hidrosalpinx  uni o bilateral

- Adenomiosis

Se les ofreció participar en el grupo control de mujeres fértiles, a aquellas que hubieren optado como método anticonceptivo la utilización de Dispositivo Intrauterino (DIU). Se realizó la biopsia endometrial el mismo día y previo a la colocación del DIU.

Obtención de las muestras de endometrio

Las muestras de biopsias de endometrio fueron obtenidas en ambos grupos, en la fase secretoria del ciclo menstrual. Fueron realizadas al día + 6 del pico endógeno de LH, el cual fue medido por tiras reactivas de ovulación en orina (One Step MedNet GmbH, sensibilidad a la LH > a 20 mIU/ml) o por LH sérica era > a 15 mUI/ml. Para confirmar que las mujeres se encontraban en la fase secretoria del ciclo, se midieron además los niveles progesterona en sangre periférica al momento de la toma de muestra. (Valor de Progesterona > 3 ng/ml)

Las biopsias fueron realizadas en consultorio, con la paciente en posición ginecológica y previa antisepsia del introito vaginal e intravaginal y colocación de espéculo. Se utilizó cureta de Novak o Pipelle de Cornier o cánula Endomete para realizar el procedimiento.

Las muestras endometriales obtenidas se colocaron en Trizol (Life Technologies) para su transporte y fueron remitidas al laboratorio donde se procesaron para la obtención de cDNA (ver RT-qPCR a continuación).

Las mismas fueron codificadas con 4 caracteres con 2 letras correspondientes a las iniciales de paciente y 2 números comenzando desde 01 hasta el 20 y siguiendo en forma consecutiva. La identidad de la paciente fue mantenida en confidencialidad durante el desarrollo del proyecto.

2.5 - RT-qPCR

Las células recuperadas luego de los distintos tratamientos fueron
resuspendidas en 500 μl de Trizol (Life Technologies) y se procedió a realizar la
extracción de ARN total siguiendo las recomendaciones del fabricante. Brevemente,
se agregan 100 ul de cloroformo, se incuba por 5 minutos y
se centrifuga por 15 minutos a 12.000 g a 4ºC. El ARN, disuelto en la fase acuosa, se
transfiere a un tubo nuevo y se precipita agregando 250 ul de isopropanol e incubando 10 min. Luego se centrifugó 10 min a 12.000 g a 4ºC. Se lava el pellet con 500 μl de etanol 75% y se resupende en 30 ul de agua libre de RNAsas. El ARN se cuantificó por
espectrometría (NanoDrop) midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm.

Para realizar el pasaje a DNA copia (ADNc) se utilizó 1 μg de ARN previamente
incubado 10 min a 60ºC y la mezcla de reacción (dNTPs 25 mM (Embiotec), oligodT 5
ng/μl (Biodynamics), RT M-MLV 100 U, RNAsin 15 U y Buffer RT M-MLV 1X (Promega)
hasta un volumen final de 20 μl. La reacción se llevó a cabo a 42ºC durante 1 h y se
detuvo incubando durante 10 min a 90ºC. El ADNc obtenido se conservó a -20ºC hasta
su uso. La qPCR se realizó mezclando 2μl de ADNc de cada muestra con los primers
correspondientes (0,20 μM) y MasterMix (Roche) hasta un volumen final de 20 μl. La
qPCR se realizó en un termociclador BioRad MyiQ2.  Se utilizó un paso previo de desnaturalización por 5 min a 94ºC antes del programa, un paso de lectura luego de cada paso de extensión y un paso de extensión final de 10 min a 72ºC al final del programa. Los primers utilizados para amplificar las distintas secuencias se describen en la Tabla 1. Se utilizaron los genes GAPDH y YWHAZ como genes housekeeping.

Tabla 1. Secuencia de los cebadores utilizados para la detección de ARNm mediante PCR. Se indica la secuencia sentido (S) y antisentido (AS) desde el extremo 5’ a 3’.

Gen	Secuencia S	Secuencia AS
YWHAZ	CAGAGAGAAAATTGAGACGGAGC	GTGACTGATCGACAATCCCTTTC
GAPDH	TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG	TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT
NLRP3	TCAGACAGAGAAGGCAGACC	GGCATATCACAGTGGGATTCG
ITGA8	TGGGAGTTTCTACTGGCAAGG	GCAGCAACTGAGTATCCAAGGT
IFGBP1	GAGCCCTGCCGAATAGAACT	GATGTCTCACACTGTCTGCTG
Prolactina	TCATCTGGTCACGGAAGTACG	GTTTCAGGATGAACCTGGCTG

2.6 - Inmunofluorescencia y análisis por Citometría de flujo

Las células cultivadas fueron recuperadas por tratamiento con TrypLE® y centrifugadas 1500 rpm por 5 minutos. Los pellets celulares obtenidos se resuspendieron y se realizó la marcación intracelular de IL-1β. Para ello las células se fijaron con Cytofix/Cytoperm durante 20 min a 4ºC y posteriormente se permeabilizaron por lavado con solución Perm/Wash (ambos de BD Biosciences). El Ac anti IL-1β (PE BD Biosciences 340516) se incubó junto con el buffer de permeabilización durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se removió el anticuerpo no pegado lavando en presencia de ese mismo buffer. El procedimiento se repitió para el Ac. secundario. Finalmente, las células se resuspendieron nuevamente en solución fijadora/permeabilizadora hasta su análisis por citometría de flujo. En forma paralela se realizó la marcación con el correspondiente control de isotipo. Finalmente, las muestras se analizaron en un Citómetro de Flujo FacsAria II (BD) y se adquirieron entre 10.000 y 50.000 eventos. Los resultados se interpretaron utilizando
el programa FlowJo® versión 7.6.2.

2.7 - Análisis estadístico

En el caso de los ensayos que involucran líneas celulares se utilizó la prueba T de Student. En el caso de los ensayos donde se utilizaron muestras de pacientes, se realizó el test no paramétrico Mann-Whitney U-test. Se utilizó el software GraphPad Prism 9 (GraphPad software Inc) para realizar las pruebas estadísticas, considerando p<0.05 como diferencia significativa.

3. Resultados

3.1 Análisis bioinformático integrado: interconexión de procesos asociados a la implantación.

Dada la complejidad de los procesos asociados a la implantación y formación de la interfase materno-placentaria y al gran número de genes asociados a los mismos, en primer lugar, se estudiaron los genes involucrados en integrar estos procesos. Para ello se realizó un análisis bioinformático que integra simultáneamente los procesos de decidualización, angiogénesis, placentación, inflamación y regulación genética. Se analizaron pathways estandarizados en bases de datos públicas como describió en Materiales y Métodos.

Posteriormente se obtuvo un listado con todos los genes que forman parte de los pathways y su relación con cada proceso. A partir de este listado, se generó la red usando el programa Gephi con los procesos como nodos representados en verdes y los genes como puntos rosados (ver figura 1A). Esta primera red cuenta con 994 genes.

A                                                                                  B                                                C

Figura 1. Análisis bioinformática integrado. A: Se analizaron pathways estandarizados en bases de datos públicas (Reactome, Gene Ontology, WikiPathways, KEGG, como se describió en Materiales y Métodos) que interconectan los procesos de angiogénesis, placentación, decidualización, Inflamación y regulación inmune. Se identificaron los genes que forman parte de los pathways y su relación con cada proceso. Con esta base se generó la red usando el programa Gephi con los procesos como nodos verdes y los genes como puntos rosados. La red cuenta con 994 genes y 1154 aristas. B: A partir de bases de datos públicas, se analizaron dos arrays de expresión comparando la expresión de genes entre células estromales sin tratar basales o tratadas con un estímulo inflamatorio (TNFα, IFNg+LPS). Los genes que se modulaban significativamente se muestran rosa, y los que no en celeste. Solo se muestran genes de grado 2 o mayor. C: Lista de genes relevantes en la red. El grado expresa en cuantos de los procesos (angiogénesis, placentación, decidualización, Inflamación y regulación genética) participa este gen.

Para restringir la lista de genes a estudiar, se realizó un nuevo análisis in síllico a partir de bases de datos públicas, pero ahora en base a dos arrays en los que se comparaba la expresión de genes entre células estromales sin tratar o tratadas con un estímulo inflamatorio (TNFα, IFNg+LPS). Se buscaron cuáles genes se modulaban diferencialmente y sobre la red anterior, se aplicó colores indicando si los genes se modulaban significativamente representados en rosa, o no, representados en celeste (Ver Figura 1B). Finalmente, de este análisis surge una lista de genes que corresponde a aquellos más relevantes que interconectan los procesos de angiogénesis, placentación, decidualización, Inflamación y regulación inmunológica (ver Figura 1C).

3.2 El programa de decidualización in vitro induce una respuesta inflamatoria estéril: producción de IL-1β activa. 

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos del análisis in sillico y que la implantación se asocia a una respuesta pro inflamatoria estéril fisiológica,  se investigó el mecanismo de activación que lleva a la producción de IL-1β activa.  Para ello se utilizó un modelo de decidualización in vitro basado en la línea celular HESC (Human Endometrial Stromal cells) previamente desarrollado en nuestro laboratorio y como se describió en la sección de Materiales y Métodos (12).

Es importante aclarar que la producción de IL-1β requiere la activación del inflamasoma para ser liberada en la forma activa. El inflamasoma es un complejo multiprotéico que es activado por un amplio rango de estímulos de diferentes fuentes y esta activación termina con la escisión y secreción de la forma activa de IL-1β (13). La mayoría de los inflamasomas que se han descrito contienen una molécula sensora (la más estudiada es NLRP3), una la proteína adaptadora y la caspasa-1, la cual es responsable de clivar la pro-IL-1β a su forma activa IL-1β.

Así, en primer lugar, nos enfocamos la expresión de NLRP3 y, como se observa en la figura 2A, las células HESC al decidualizarse aumenta significativamente la expresión NLRP3 en comparación con las no decidualizadas. A continuación, investigamos la producción de IL‑1β antes y después de la decidualización por marcación intracitoplasmática y citometría de flujo. La figura 2B muestra que la producción de IL-1β aumenta significativamente luego de la decidualización en células HESC.

Figura 2: Activación del inflamasoma NLRP3 y producción de IL-1β.

A                                              B                                                          C

Figura 2: Activación del inflamasoma NLRP3 y producción de IL-1β. Dado que la producción de IL-1β requiere la activación del inflamasoma para ser liberada en la forma activa, evaluamos la expresión de NLRP3 y la producción de IL-1β. A: Esquema del inflamasoma NLRP3,  complejo multiproteico formado por la molécula sensora (NLRP3), una la proteína adaptadora y la caspasa-1 (responsable de clivar a pro-IL-1β a su forma activa IL-1β). B y C: La línea celular HESC (Human Endometrial Stromal cells) fue cultivada hasta alcanzar la confluencia y decidualizadas en presencia de medroxiprogesterona y dibutiril AMPc durante 8 días. Las células no decidualizadas (No Dec) y decidualizadas (Dec) se analizaron para la expresión de NLRP3 por RT-qPCR. La expresión de NLRP3 se muestra normalizada con respecto a GAPDH. La producción de IL-1β activa  se cuantificó por marcación intracelular y análisis por citometría de flujo. Los resultados se muestran como porcentaje de células positiva para IL-1 β.

Las barras corresponden a la media ± SEM de al menos 5 ensayos independientes (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 prueba t de Student)

Receptividad endometrial: análisis de biopsias endometriales de pacientes con RIF y de mujeres fértiles.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el modelo in vitro de decidualización, realizamos un nuevo análisis bioinformático integrando arrays de biopsias endometrio. A partir de bases de datos públicas, se encontraron tres arrays en los que se comparaba la expresión de genes entre biopsias endometriales de mujeres fértiles vs pacientes con RIF.

Se buscaron cuáles genes se modulaban diferencialmente (en al menos un array) y sobre la red creada previamente (Figura 1B) que integraba los procesos, se aplicó colores indicando si los genes se modulaban significativamente (rosa) o no (celeste), (ver Figura 3). Es importante destacar que el 52% de los genes con grado 2 o más, es decir aquellos que intervienen en al menos dos procesos, están significativamente modulados, lo que denota la relevancia de estos genes para el estudio de las pacientes RIF.

Figura 3. Análisis bioinformática integrado  de arrays de biopsias endometrio.

A partir de bases de datos públicas, se encontraron tres arrays en los que se comparaba la expresión de genes entre biopsias endometriales de mujeres fértiles vs pacientes con fallas reiteradas en las fertilizaciones in vitro (RIF). Se obtuvieron los genes modulados diferencialmente en al menos un array y sobre la red anterior, se identificó con colores indicando si los genes se modulaban significativamente (rosa) o no (celeste). En la red solo se muestran genes que estén involucrados en 2 o más procesos. El 52% de los genes mostrados presenta modulación.

A continuación, se validó la expresión de algunos de estos genes en biopsias de endometrio obtenidas de pacientes con RIF y se las comparó con la obtenida a partir de biopsias endometriales de mujeres fértiles. Las muestras de endometrio fueron obtenidas durante la fase secretoria del ciclo menstrual según los criterios detallados en Materiales y Métodos. En la tabla 2 se muestras las características de ambos grupos de mujeres.

Tabla 2. Datos clínicos de las pacientes con RIF y de mujeres fértiles. Los valores se muestran como mediana y rango.

Características	Fértiles	RIF
N	17	14
Edad	38 (31-42)	35 (33-39)
Nacimientos	2 (1-5)	0
Fallas recurrentes en implantación	0	5 (2-9)

A partir de las biopsias obtenidas de ambos grupos de pacientes se obtuvo el correspondiente cDNA y se analizó la expresión génica por RT-qPCR. Como muestran las Figuras 4A y B, los endometrios obtenidos de pacientes con RIF presentaron disminuidos significativamente la expresión de los marcadores característicos de decidualización IFGB1 y prolactina en comparación con la observada en muestras de mujeres fértiles.

A                                                                     B

C                                                                     D

NLRP3

Figura 4: Receptividad endometrial: análisis de biopsias endometriales. Se obtuvieron biopsias endometriales durante la fase secretora del ciclo menstrual de pacientes con RIF y de mujeres fértiles. Las muestras se procesaron mecánicamente, se aisló el ARN y se generó ADNc.  Se estudió la expresión de A: IGFBP1, B: Prolactina, C: NLRP3 y D: ITGA8 por RT-qPCR. En las pacientes RIF, el proceso de decidualización fue acompañado de una menor expresión de los marcadores de decidualización IGFBP1 y PRL, así como de la subunidad NLRP3 del inflamasoma y de la integrina ITGA8. Los resultados se expresaron como 2-ΔCt normalizando a los genes housekeeping GAPDH o YWHAZ. *p<0,05, ***p<0,005, ****p<0.0001, Mann-Whitney U-test

Dado que el programa de decidualización regula la respuesta inflamatoria y la expresión de la familia de integrinas responsables de mediar la adhesión estable del blastocisto, se investigó la expresión de NLRP3 y de la integrina ITGA8 (14,15) en ambos grupos de pacientes. Como se observa en las Figuras 4C y D, la expresión de NLRP3 fue significativamente menor en las biopsias de pacientes con RIF en comparación con la observada en los endometrios de las mujeres fértiles; acompañado por una marcada reducción en la expresión de la integrina ITGA8.

Estos resultados sugieren que el endometrio de las pacientes con RIF presenta alteraciones en el programa de decidualización que llevarían a una inadecuada expresión de marcadores característicos, así como a alteraciones en la respuesta inflamatoria y en el mecanismo de adhesión del blastocisto.

Discusión

En este trabajo, nos enfocamos en algunos genes que resultan críticos para integrar procesos que acompañan la decidualización e implantación embrionaria; y cómo ciertas alteraciones en los mismos podrían pre condicionar el endometrio de pacientes con RIF.

En primer lugar, realizamos un análisis in sillico integrado los procesos de angiogénesis, placentación, decidualización, inflamación y regulación inmune que nos permitió identificar una red de genes que los conectan. Luego utilizamos un modelo de decidualización in vitro, basado en la línea celular HESC, mediante el cual pudimos confirmar la decidualización se acompaña de la producción de IL-1β activa. A su vez, en otro análisis integrado bioinformático abordamos la expresión diferencial de genes a partir de arrays de pacientes con RIF, encontrando que más de la mitad de los genes que unen los distintos procesos están alterados en pacientes con RIF. Finalmente, validamos algunos de los genes identificados en muestras de pacientes con RIF y fértiles lo que nos permitió concluir que el endometrio de las pacientes con RIF presenta alteraciones en el programa de decidualización, en la respuesta inflamatoria y en consecuencia en el mecanismo de adhesión (attachment) del blastocisto (Figura 5).

Figura 5: Condicionamiento de la receptividad endometrial en pacientes con fallas recurrentes en las fertilizaciones in vitro: resumen gráfico del trabajo. El endometrio de las pacientes con RIF presenta alteraciones en el programa de decidualización asociado a una inadecuada expresión de marcadores característicos; llevando a alteraciones en la respuesta inflamatoria fisiológica y en consecuencia disminuiría la adhesión estable (attachment) del blastocisto al epitelio uterino.

En trabajos ya publicados, el modelo in vitro de decidualización permitió estudiar la generación de un microambiente proinflamatorio asociado a la implantación embrionaria exitosa (12,17). Con respecto a la producción de IL-1β, esta citoquina resulta clave en la regulación de la respuesta inflamatoria en el período peri-implantacional (3,18). Particularmente, un nivel moderado de IL-1β tiene función proimplantatoria, modulando la expresión de proteínas de remodelación de matriz extracelular e incrementado la expresión de integrinas en el endometrio, que luego mediarán la adhesión estable del blastocisto (14,15,19). Las integrinas son las glicoproteínas dominantes en la adhesión debido a su capacidad para unirse a los ligandos de la matriz extra celular para mediar la adhesión y de reorganizar citoesqueleto para estabilizar la adhesión del blastocisto. La contribución de las integrinas a la adhesión del blastocisto al epitelio luminal ha sido muy bien caracterizado en distintos modelos animales y específicamente la ITGA8 en el modelo bovino (15).

Cuando estudiamos las biopsias de pacientes con RIF, encontramos una disminución en los marcadores IFGBP1 y prolactina, ambos marcadores del programa de decidualización.  Este programa cíclico en humanos contribuye al “precondicionamiento“ del endometrio y de él depende la receptividad endometrial (20,21).

Más aún, las pacientes con RIF también presentaron disminuida significativamente la expresión NLRP3, una subunidad del inflamasoma, lo que indica una respuesta inflamatoria inadecuada. A su vez, la respuesta inflamatoria también es responsable de inducir la activación de las integrinas, en consecuencia, se afectaría la adhesión estable del blastocisto. En ese sentido, evidenciamos una marcada disminución de la expresión de la integrina ITGA8, que nos sugiere que la adhesión estable del blastocisto estaría disminuida en este grupo de pacientes.

Finalmente, el uso de herramientas bioinformáticas que combinan múltiples vías de señalización junto con el análisis de expresión de genes en arrays públicos, presenta una gran oportunidad para explorar posibles genes clave en la regulación de los procesos asociados a la reproducción. En el presente trabajo utilizando herramientas bioinformáticas muy novedosas, exploramos los potenciales genes más relevantes y sentamos las bases para profundizar en los mecanismos asociados a la decidualización y a la implantación embrionaria.  Además, exploramos los cambios en la expresión génica tanto en un modelo in vitro de decidualización, como en endometrios de mujeres fértiles y mujeres con RIF, evidenciando en este último grupo (RIF) una respuesta inflamatoria inadecuada que a su vez condiciona la adhesión del blastocisto, aportando así al entendimiento que subyacen a las fallas reiteradas en las implantaciones in vitro.

Identificar los mecanismos alterados en la receptividad endometrial aportaría desde la investigación básica al diseño de nuevas estrategias terapéuticas impactando a futuro en el éxito de los tratamientos de fertilización asistida y especialmente en pacientes con RIF.

Referencias

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